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色譜柱的使用和維護

  色譜柱的正確使用和維護十分重要,稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操縱過程中,需要留意下列題目,以維護色譜柱。
 
  ① 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的忽然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況;柱壓的忽然升高或降低也會沖動柱內填料,因此在調節流速時應該緩慢進行,在閥進樣時閥的轉動不能過緩(如前所述)。
 
  ② 應逐漸改變溶劑的組成,特別是反相色譜中,不應直接從有機溶劑改變為全部是水,反之亦然。
 
  ③ 一般說來色譜柱不能反沖,只有生產者指明該柱可以反沖時,才可以反沖除往留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。
 
  ④ 選擇使用適宜的活動相(尤其是pH),以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預柱,分析柱是鍵合硅膠時,預柱為硅膠,可使活動相在進進分析柱之前預先被硅膠"飽和",避免分析柱中的硅膠基質被溶解。
 
  ⑤ 避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注進柱內,需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經常更換。
 
  ⑥ 經常用強溶劑沖洗色譜柱,清除保存在柱內的雜質。在進行清洗時,對流路系統中活動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡,每種活動相的體積應是柱體積的20倍左右,即常規分析需要50~75ml。
 
  下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序,作為參考:硅膠柱以正已烷(或庚烷)、二氯甲烷和甲醇依次沖洗,然后再以相反順序依次沖洗,所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗往殘留的強極性雜質,已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷(或氯仿)依次沖洗,再以相反順序依次沖洗。假如下一步分析用的活動相不含緩沖液,那么可以省略zui后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗往殘留的非極性雜質,在甲醇(乙腈)沖洗時重復注射100~200μl四氫呋喃數次有助于除往強疏水性雜質。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除往類脂。有時也注射二甲亞砜數次。此外,用乙腈、丙酮和三氟醋酸(0.1%)梯度洗脫能除往蛋白質污染。
 
  陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗,陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗,除往交換性能強的鹽,然后用水、甲醇、二氯甲烷(除往吸附在固定相表面的有機物)、甲醇、水依次沖洗。
 
  ⑦ 保存色譜柱時應將柱內布滿乙腈或甲醇,柱接頭要擰緊,防止溶劑揮發干燥。盡對禁止將緩沖溶液留在柱內靜置過夜或更長時間。
 
  ⑧ 色譜柱使用過程中,假如壓力升高,一種可能是燒結濾片被堵塞,這時應更換濾片或將其取出進行清洗;另一種可能是大分子進進柱內,使柱頭被污染;假如柱效降低或色譜峰變形,則可能柱頭出現塌陷,死體積增大。
 
  在后兩種情況發生時,小心擰開柱接頭,用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度(留意把被污染填料取凈)再把柱內填料整平。然后用適當溶劑濕潤的固定相(與柱內相同)填滿色譜柱,壓平,再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善,但是很難恢復到新柱的水平。
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